.gif){kind=spacer}
Среды для испытания антибиотиков
Antibiotic Assay Media
Среды используются в микробиологических исследованиях по определению различных антибиотиков в продуктах фармации, пищевых продуктах и др. Ниже представлен список имеющихся сред.
Antibiotic Assay Medium
No36 (M290)
Рост на среде без антибиотиков
|
|
Состав сред для испытания антибиотиков (грамм/литр)
Среды для испытания антибиотиков (N) | ||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Ингредиенты | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 19 | 32 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 |
Коды I.P.> | A | B | C | E | F | H | D | G | I | J | ||||||||||||
Пептический перевар животной ткани | 6,0 | 6,0 | 5,0 | 6,0 | 6,0 | – | 6,0 | – | – | 6,0 | 10,0 | 10,0 | 9,4 | 6,0 | 10,0 | 10,0 | 15,0 | 5,0 | 2,5 | |||
Гидролизат казеина | 4,0 | – | – | – | – | 17,0 | – | 17,0 | 17,0 | 4,0 | – | 4,0 | 15,0 | 17,0 | 2,5 | 9,0 | ||||||
Папаиновый гидролизат соевой муки | – | – | – | – | – | 3,0 | – | 3,0 | 3,0 | – | – | 5,0 | 3,0 | 5,0 | ||||||||
Дрожжевой экстракт | 3,0 | 3,0 | 1,5 | 3,0 | 3,0 | – | 3,0 | – | – | 3,0 | 5,0 | 4,7 | 3,0 | 1,5 | 20,0 | 5,0 | ||||||
Мясной экстракт | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | – | 1,5 | – | – | 1,5 | 2,5 | 2,4 | 1,5 | 10,0 | 10,0 | 1,5 | ||||||
Глюкоза | 1,0 | – | 1,0 | 1,0 | – | 2,5 | – | 2,5 | 2,5 | 1,0 | 10,0 | 20,0 | 10,0 | 1,0 | 5,0 | 2,5 | 5,5 | 1,0 | 10,0 | 20,0 | ||
Натрия хлорид | – | – | 3,5 | – | – | 5,0 | – | 5,0 | 5,0 | – | 10,0 | 10,0 | 3,0 | 3,0 | 5,0 | 4,0 | 3,5 | |||||
Натрия гидрофосфат | – | – | 3,68 | – | – | 2,5 | – | 2,5 | 2,5 | – | – | |||||||||||
Натрия цитрат | 10,0 | |||||||||||||||||||||
Натрия сульфит | 0,2 | |||||||||||||||||||||
Калия гидрофосфат | 2,5 | 3,68 | 1,0 | |||||||||||||||||||
Калия дигидрофосфат | – | – | 1,32 | – | – | – | – | – | – | – | – | 1,32 | 2,0 | 1,0 | ||||||||
Марганца сульфат | – | – | – | – | – | 0,03 | – | – | – | – | – | 0,3 | ||||||||||
Твин-80 (полисорбат) | – | – | – | – | – | – | – | – | 10,0 | – | – | 0,1 | ||||||||||
Агар-агар | 15,0 | 15,0 | – | 15,0 | 15,0 | – | 15,0 | 20,0 | 12,0 | 15,0 | 25,0 | 23,5 | 15,0 | 17,0 | 15,0 | 15,0 | 10,0 | |||||
L-цистеин | 0,7 | |||||||||||||||||||||
Глицерин | 10,0 | 10,0 | ||||||||||||||||||||
Значение рН (25°С)* | 6,6 | 6,6 | 7,0 | 6,6 | 7,9 | 7,0 | 5,9 | 7,2 | 7,2 | 8,3 | 6,0 | 5,6 | 6,1 | 6,6 | 7,0 | 7,0 | 7,3 | 7,3 | 7,0 | 7,9 | 6,7 | 6,8 |
Навеска (г/л) | 30,5 | 25,5 | 17,5 | 26,5 | 25,5 | 30,0 | 25,5 | 50,0 | 52,0 | 30,5 | 62,5 | 30,0 | 60,0 | 30,8 | 33,0 | 50,0 | 40,0 | 30,0 | 45,4 | 17,5 | 47,1 | 46,0 |
Примечание: * допустимые отклонения от указанного значения ± 0,2 | ||||||||||||||||||||||
Приготовление:
Размешать соответствующее количество порошка (см.таблицу) в 1000 мл дистиллированной воды. Подогреть до полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (121°С) в течение 15 мин или следовать указаниям, изложенным на этикетке соответствующей среды.
Принцип и оценка результата:
Указанные среды используются для проведения исследований с антибиотиками. Суть и детали этих исследований изложены в исчерпывающем труде Grove и Randall (1). Исследования с применением жидких сред ранее описаны Schmidt и Moyer (2). Среды для испытания антибиотиков готовятся согласно указаниям, приведенным в американской Фармакопее (3, 4) и других официальных документах (5). Среду N 19 готовят по прописи Kirshbaum и Areet (6). Применение данных сред гарантирует получение соответствующих зон задержки роста у референс-штаммов. При этом необходимо тщательно соблюдать все условия проведения исследований. Применение стандартных питательных сред является одним из важнейших условий для получения адекватных результатов.
Источниками необходимых питательных веществ и факторов роста в средах служат такие ингредиенты, как пептический перевар животной ткани, гидролизат казеина и/или папаиновый перевар соевой муки, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и др. Натрия хлорид обеспечивает необходимое осмотическое давление, фосфаты – буферность (противодействие сдвигу рН). В некоторых средах в качестве источника углерода и энергии присутствует глюкоза. Такие ингредиенты, как сульфат марганца, сульфит натрия, L-цистеин, твин-80, добавлены в некоторые среды в соответствии с питательными потребностями культивируемых микроорганизмов.
Методы исследования
1. Метод цилиндров.
Впервые метод был предложен Abraham и соавт. (7), а затем модифицирован Schmidt и Moyer (2). Суть метода заключается в том, что антибиотик диффундирует из стальных полых цилиндров, установленных вертикально на поверхность засеянного агара. В результате вокруг цилиндра формируется зона задержки роста, величина которой пропорциональна концентрации антибиотика. Обычно этот метод используют для испытания фармпрепаратов пенициллина и других антибиотиков. Для испытания применяют круглые чашки Петри размером 20 х 100 мм и полые стальные или фарфоровые цилиндры длиной 10 мм, имеющие внешний диаметр 8 мм и внутренний диаметр 6 мм (± 0,1 мм). Цилиндры должны быть абсолютно чистыми. При исследовании двухслойным методом посевной (верхний) агар, содержащий тест-культуру, надо вносить после полного затвердевания агаровой основы (нижнего слоя). В большинстве случаев для формирования нижнего слоя требуется 21 мл среды, посевного слоя – 4 мл. На 1 чашку обычно устанавливают до 6 цилиндров, на одинаковом удалении друг от друга и от края чашки.
2.Метод лунок.
В засеянном агаре специальным устройством вырезают лунки, в которые затем вносят растворы антибиотиков. Технология испытания подобна методу цилиндров.
3.Метод бумажных дисков.
Бумажные диски диаметром 9 мм пропитывают раствором антибиотика и накладывают на засеянную питательную среду. Антибиотик можно также нанести на диск, уже помещенный на питательную среду. Для данных исследований можно использовать чашки с толщиной агара 2 мм. Последующие этапы подобны описанным в методе цилиндров. В зависимости от требуемого значения рН можно использовать либо среду N 2, либо среду N 5.
4.Метод серийных разведений.
Антимикробную активность антибиотика можно определять количественно через минимальную ингибирующую концентрацию (МИК). Для этого надо использовать тест-культуру с известной чувствительностью к определенному антибиотику (величиной МИК). Из испытуемого раствора антибиотика готовят серийные (например, двукратные) разведения в одной из указанных жидких сред. Затем в каждое разведение вносят определенное количество тест-культуры. Пробирка с последним разведением, где наблюдается отсутствие мутности (подавляется рост тест-культуры), указывает на активность антибиотика в концентрации, соответствующей величине МИК.
5.Турбидиметрический метод.
Метод основан на измерении мутности в среде с определенной концентрацией антибиотика, что зависит от степени подавления роста тест-культуры. Преимущество, по сравнению с методом цилиндров, состоит в более коротком инкубировании (3-4 ч). Для испытаний используют абсолютно чистые пробирки размером 18 х 150 мм. В них готовят рабочие разведения стандартных («эталонных») препаратов антибиотиков в определенных концентрациях. Затем к 1 мл каждой концентрации добавляют 9 мл засеянного бульона. Одновременно тестируют таким же образом приготовленные растворы испытуемого препарата. Инкубирование пробирок ведут в водяной бане при соответствующей температуре в течение 3-4 ч. Затем останавливают рост добавлением в пробирку 1 капли формалина и измеряют на спектрофотометре степень прозрачности растворов. Концентрацию антибиотика в пробе определяют после сравнения с результатами испытания «эталонного» препарата.
Выбор питательной среды и референс-штаммов: данные представлены в таблице (см. ниже).